Rennes étant une ville universitaire, elle se devait d'avoir un espace botanique pratiqué par les étudiants de pharmacie. La décision de créer le jardin botanique est prise en 1796, il est alors dirigé par Jean Danthon, professeur de botanique à l'école de médecine, assisté du professeur Jean-Yves Degland qui lui succède en 1808.

Sur son plan de 1868, Bühler le déplace dans la partie orientale du Thabor, en aménageant le nouveau jardin en 11 plates-bandes concentriques de 1,50 mètres de large, selon la classification systématique née des travaux d'Antoine de Jussieu (1748-1836), revue par le botaniste Augustin-Pyramus de Candolle (1778-1841).

Cette organisation spatiale organise le monde végétal en 4 classes, respectivement acotylédones (fougères), monocotylédones (graminées, laîches, joncs, iris…), dicotylédones (digitales, marguerites, campanules, renoncules, sauge…) et gymnospermes (conifères) les uns à la suite des autres. Suivant les principes de la botanique classique, l'ensemble retrace l'évolution de la végétation et se visite dans le sens des aiguilles d'une montre, en spirale, de l'extérieur vers l'intérieur, la déambulation mène des herbes les plus simples et se poursuit jusqu'aux végétaux plus élaborés tels que les arbres. Ces derniers sont donc concentrés autour du bassin qui est au centre du jardin botanique.

Cette disposition n'a pas l'approbation de Bühler qui proposait, a contrario, une organisation rectangulaire, qu'il considérait comme plus moderne : "Il faut se mettre à la hauteur du progrès plutôt que de suivre les indications de quelques vieux professeurs qui n'osent pas innover de peur de se tromper" écriit-il au maire (lettre du 5 octobre 1867). Malgré ce désaccord, la disposition circulaire est adoptée et Bühler la transcrit sur son plan ; un bassin, dit "aux carpes", de forme arrondie en occupe le centre et des plantes aquatiques flottent à sa surface. Groupées par familles, sont présentées plus de 3000 espèces végétales (arbres, arbustes, plantes herbacées), représentant près de 1500 genres. Rennes est une des rares villes à avoir conservé cette classification dans son intégralité.

Une roseraie est aménagée sur une douzième platebande circulaire (entièrement renouvelée entre 2009 et 2013, remplacement de terre végétale et nouvelles plantations) sur le pourtour du jardin botanique et le long du mur le séparant de la rue de la Palestine, exposé au sud. Au nord-ouest du jardin botanique, le carré des nouveautés, créé en 1956, présente les espèces de moins de 10 ans, renouvelées chaque année. Depuis 1990, les espèces créées avant 1914 sont regroupées au sud-est du jardin botanique dans le carré des roses anciennes.

En 2021, la roseraie propose quelques 2000 rosiers se déclinant en près de 1000 variétés (dont plus de 600 dans la roseraie circulaire), plantées en buissons mais aussi en tiges et demi-tiges. Les rosiers grimpants ornent les tonnelles et les pergolas disposées à l'est du jardin. Au nord-est du jardin botanique, une parcelle présente une importante collection de dahlias et, près de la maison de l'ancien octroi, de nombreux chrysanthèmes à massifs.

Les statues La Pensée de Gabriel-Jules Thomas, 1870 (située au centre du carré des nouveautés) et Le Jeune Savoyard pleurant sa marmotte de Pierre Gourdel, 1872 (au centre du carré des roses anciennes) ont été retirées de la roseraie, à la fin des années 2010, pour regagner les collections du musée des beaux-arts de Rennes.

Les rosiers fleurissent au début de l'été et les dahlias plus tardivement (août-septembre).

L'ensemble de la collection est géré sans aucun pesticide et d'autres pratiques environnementales, telle que le compostage, sont mises à contribution dans son entretien.

D'importants travaux de rénovation du jardin botanique sont entrepris à la fin des années 2010, avec notamment le remplacement des buis de bordure, symbole du jardin à la française, victimes de parasites et de maladies.

Dans le jardin botanique, les plantes sont étiquetées de couleur différente en fonction de leur spécificité (alimentaires, médicinales, toxiques, etc.), on y touve également l'initiale du botaniste qui a baptisé la plante ; une réflexion est désormais engagée sur le sujet de la signalétique afin de proposer aux visiteurs un système plus interactif et qualitatif d'information.

Il est à noter que le jardin botanique du Thabor dispose d'une grainothèque et en publie régulièrement un catalogue. Au total, plus de 2000 espèces de végétaux sont récoltés, triés et classés pour être conservées au sein de cette grainothèque ; ce qui génèrent, chaque année, des centaines d'échanges d'échantillons avec d'autres institutions, villes et universités à travers le monde.